2 × Rychlý SYBR Green QPCR Master Mix (nízká ROX)

 

Název produktu	Kočka. Žádný.	Specifikace.
2× Fast SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX)	G3324-01	1 ml
	G3324-05	5×1 ml
	G3324-15	15×1 ml

 

 

2× Fast SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX) je speciální 2× premix pro qPCR reakci pomocí chimérické fluorescenční metody SYBR Green I, která obsahuje všechny složky qPCR kromě primerů a templátů DNA, které mohou zkrátit operační kroky, zkrátit dobu přidávání vzorků a snižuje možnost kontaminace. Základní složkou je geneticky upravený hot-start Taq DNA polymeráza, která účinně izoluje aktivitu DNA polymerázy a zabraňuje nespecifické amplifikaci při nízkých teplotách účinnou kombinací monoklonální protilátky a Taq DNA polymerázy, s mnoha výhodami, jako je vysoká specificita a vysoká citlivost, a je spojen s reakčním pufrem optimalizovaným pro qPCR. Je velmi vhodný pro vysoce specifickou a vysoce senzitivní qPCR reakci. Tento produkt je 2× předem namíchané činidlo obsahující optimální koncentraci SYBR Green I pro qPCR reakci, které může získat dobrou standardní křivku v široké kvantitativní oblasti, přesnou kvantifikaci cílových genů, dobrou reprodukovatelnost, vysokou spolehlivost a nejrychlejší reakci qPCR lze dokončit za 30 minut.

 

 

Loď s mokrým ledem. Skladujte při -20 stupních bez světla, platnost 12 měsíců. Vyhněte se cyklům zmrazování a rozmrazování. Po rozmrazení může být stabilně skladován při 4 stupních po dobu jednoho měsíce bez světla.

 

 

Komponent	G3324-01	G3324-05	G3324-15
2× Fast SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX)	1 ml	5×1 ml	15×1 ml
Manuál	Jedna kopie

 

 

Před zahájením

1. Real Time PCR amplifikační přístroj;

2. Speciální reakční trubice nebo reakční deska pro experiment;

3. PCR primery (principy návrhu referenčních primerů);

4. Mikropipety a hroty pro autoklávování;

 

 

1. Doporučený reakční systém PCR

Komponent	20 μl rxn	50 μl rxn	Závěrečné soustředění
2× Fast SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX)	10 μL	25 μL	1×
Forward Primer (10 µM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Reverzní primer (10 μM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Šablona b	Variabilní	Variabilní	podle potřeby
Voda bez nukleázy	Přidejte do 20 μl	Přidejte do 50 μl

A. Obvykle lze dobrého zesilovacího účinku dosáhnout s konečnou koncentrací {{0}},2 μM. Když je výkon reakce špatný, lze koncentraci primeru upravit v rozsahu 0.2-1,0 μM.

b. Množství přidaného templátu se mění v závislosti na počtu kopií cílového genu a vhodné množství přidaného templátu se studuje gradientovým ředěním. Nejlepší přídavné množství templátové DNA v 20 μl reakčním systému bylo méně než 100 ng. Když byla jako templát použita cDNA (RT reakční roztok) reakce RT-PCR, nemělo by přidané množství překročit 10 % konečného objemu qPCR.

2. Postup PCR reakce (lze upravit podle přístrojů):

3.

Fáze	Krok	Počet cyklů	Teplota	Čas
Fáze 1	Předegenerace	1	95 stupňů	30 sec
Fáze 2	Degenerace	40	95 stupňů	3-10 s
	žíhání-prodloužení		60 stupňů	10-30 sec
Fáze 3	křivka tání	1	Výchozí nastavení přístroje

Doporučuje se používat přednostně rychlý postup fluorescenčního kvantitativního PCR přístroje odpovídající značky, který je kompatibilní se standardním amplifikačním postupem. Rychlý postup je vhodný pro většinu genů a standardní postup lze vyzkoušet u některých genů se složitou sekundární strukturou.

a: Šablona genomu může prodloužit dobu před degenerací o 2-3 min;

b: Fáze cyklu: doba denaturace standardního postupu je 10 sekund. Pokud je amplifikovaný fragment menší než 200 bp, nejkratší možnost rychlého postupu je 3 sekundy.

c: Fáze cyklu: standardní doba žíhání/prodlužování je zvolena na 30 sekund; Pokud je amplifikovaný fragment menší než 200 bp, nejkratší postup by mohl být vybrán jako 10 sekund. Nad 200 bp je doporučená volba 30 sekund; Pro sběr fluorescenčního signálu nastavte prosím experimentální postup podle návodu k použití přístroje.

 

 

1. Před použitím jemně promíchejte dnem vzhůru. Nevířte a neprotřepávejte, aby nevznikly bubliny. Před použitím činidla dobře promíchejte.

2. Reagencie by měly být při přípravě reakčního roztoku umístěny na led.

3. Produkt obsahuje fluorescenční barvivo SYBR Green, proto je třeba se při přípravě reakčního roztoku PCR vyhnout silnému světlu.

4. Pro přípravu a balení reakčního roztoku použijte novou jednorázovou hlavu, aby se zabránilo kontaminaci mezi vzorky.

5. Vyhněte se opakovanému zmrazování a rozmrazování Master Mix a pokuste se jej použít do jednoho měsíce po rozmrazení.

 

 

Značka stroje PCR	G3323 (Žádný ROX)	G3324 (Nízký ROX)	G3325 (Vysoký ROX)
Životnost ABI Thermo	PikoRealTM Cycler	7500/7500 rychle, Řada ViiA 7™ QuantStudio™	5700/7000/7300/7700/7900/ 7900HT/7900 HT Fast,StepOne™, StepOne Plus™
Úskok		Mx3000P®/3005P™/4000™
Bio-Rad	Všechny série
Eppendorf	Realplex 2s, Mastercycler®ep realplex
Ilumina	Eco QPCR
Cepheid	SmartCycler®
Qiagen Corbett	Řada Rotor-Gene®
Roche	Řada LightCycler™
Takara	Série Thermal Cycler Dice
Analytikjena	řada qTOWER
qTOWER	Řada LineGene

 

 

1. Délka amplifikačního produktu se doporučuje mezi 80-300 bp;

2. Délka primeru: 18-25 bp;

3. Obsah báze G+C v primerech by měl být mezi 40 %-60 %;

4. Rozdíl v hodnotě Tm mezi dopřednými primery a reverzními primery je menší než 2 stupně a hodnota Tm mezi 58-62 stupněm je nejlepší;

5. Náhodnost rozdělení bází;

6. Primery by neměly obsahovat samokomplementární sekvence, jinak vytvoří sekundární vlásenkovou strukturu;

7. Mezi dvěma primery by neměly být více než 4 komplementární nebo homologní báze, jinak se vytvoří dimer primeru, zejména komplementární překrytí na 3' konci;

8. 3' terminální báze primeru je navržena jako G nebo C;

9. Ve výsledcích srovnání NCBI nebyly nalezeny žádné další nespecifické produkty.

 

 

Popis problému	Možné důvody	Řešení
Na konci reakce se neobjevila žádná amplifikační křivka nebo se hodnota CT objevila příliš pozdě	Koncentrace templátu je příliš nízká	Opakujte experiment, abyste snížili násobek ředění šablony, a začněte od nejvyšší koncentrace, když koncentrace vzorku není známa
	Degradace šablony	Šablona byla znovu připravena a experiment byl opakován
	V systému jsou inhibitory PCR	Obecně platí, že templát se vnáší dovnitř, ředicí poměr templátu se zvyšuje nebo se templát s vysokou čistotou znovu připravuje a opakuje
	Primery mohou degradovat	Primery, které nebyly delší dobu používány, by měly být nejprve testovány na integritu elektroforézou PAGE, aby se vyloučila možnost degradace
	Nízká účinnost zesílení	Zvyšte koncentraci primeru, vyzkoušejte tříkrokovou amplifikační proceduru nebo přepracujte primer
	Produkt amplifikace je příliš dlouhý	Délka amplifikačního produktu byla řízena v rozsahu 80-300 bp
Kontrolka prázdného místa zobrazuje signál	Znečištění reakčního systému	Nejprve by měla být vyměněna kontrolní voda. Pokud stále nastane stejná situace, je třeba vyměnit primery, aspirátory a zkumavky PCR nebo spustit nový Master Mix. Reakční systém je připraven v super čistém stole, aby se snížilo znečištění aerosolem
	Objevuje se nespecifická amplifikace, jako jsou primerové dimery	Obecně je normální, že se amplifikační produkty objeví ve slepé kontrole po 35 cyklech, které by měly být analyzovány pomocí křivky tání. Přepracujte primer, upravte koncentraci primeru nebo optimalizujte postup PCR reakce
Křivka tání má více vrcholů	Návrh základního nátěru je špatný	Nový základní nátěr byl přepracován podle zásad návrhu základního nátěru
	Koncentrace primeru je příliš vysoká	Přiměřeně snižte koncentraci primeru
	V templátu cDNA je genomová kontaminace	Extrahovaný roztok RNA je štěpen pomocí enzymů DNA, jako je dsDNáza, k odstranění genomové kontaminace nebo k navržení transintronových primerů.
Špatná reprodukovatelnost experimentů	Chyba přidání vzorku je velká	použití přesné pipety s vysoce kvalitní sací hlavou přesné pipety; Šablona s vysokým ředěním, přidání šablony velkého objemu pro snížení chyb při odběru vzorků; Reakční objem qPCR byl zvětšen
	Koncentrace templátu je příliš nízká	Opakujte experiment, abyste zkrátili časy ředění šablony
	Odchylka teploty na různých místech přístroje qPCR	Pravidelně kalibrujte přístroj qPCR
Křivka zesílení není hladká	Fluorescenční signál je příliš slabý, vzniká po korekci systému	Ujistěte se, že barviva předem smíchaná v Master Mix nejsou degradována; Vyměňte fluorescenční signál, abyste získali lepší spotřební materiál qPCR
Křivka zesílení se zlomí nebo sklouzne	Koncentrace templátu byla vyšší a výchozí koncová hodnota byla vyšší než hodnota CT	Výchozí koncový bod (hodnota Ct -3) byl snížen a data byla znovu analyzována
Zesilovací křivky jednotlivých Wells náhle prudce klesly	V reakční trubici jsou bubliny	Zajistěte, aby byl MIX zcela rozpuštěný a nevířil a nekmital rovnoměrně; Po přidání vzorku se bublinky odstraní odstředěním pomocí lehkého elastického materiálu. Doba předdenaturace byla prodloužena na 10 minut, aby se odstranily bubliny

 

Pouze pro výzkumné účely!

 

 

Populární Tagy: 2 × rychlý sybr zelený qpcr master mix (nízký rox), Čína 2 × rychlý sybr zelený qpcr master mix (nízký rox) výrobci, dodavatelé, továrna