2× Universal Blue Multiplex Probe QPCR Master Mix（s UDG）

 

Název produktu	Kat.č.	Spec.
2× Universal Blue Multiplex Probe qPCR Master Mix (s UDG)	G3348-01	1 ml
	G3348-05	5×1 ml
	G3348-15	15×1 ml

 

 

Produkt je 2×univerzální fluorescenční kvantitativní PCR premix založený na sondové metodě, po speciální optimalizaci vícenásobného fluorescenčního kvantitativního PCR reakčního systému až po čtyřnásobnou fluorescenční kvantitativní PCR reakci ve stejné reakční zkumavce. Výrobek zároveň obsahuje unikátní korekční barvivo, které je kompatibilní se všemi qPCR zařízeními a není potřeba upravovat koncentraci ROX na různých přístrojích. Do premixu se přidává modré barvivo, které slouží jako indikátor při přidávání vzorků na čirou reakční desku. Kromě toho produkt také obsahuje uracil-DNA glykosylázu (UDG) a speciálně optimalizované množství přídavku dUTP, které může zabránit křížové kontaminaci zbytkové kontaminace šablony produktu a zlepšit specifičnost, citlivost a přesnost produktu.

 

 

Dodáváno s mokrým ledem a skladováno při -20 stupních ; platí až 12 měsíců.

 

 

Číslo součásti	Komponent	G3348-01	G3348-05	G3348-15
G3348-01	2× Universal Blue Multiplex Probe qPCR Master Mix (s UDG)	1 ml	5×1 ml	15×1 ml
Manuál		Jedna kopie

 

 

1. Vyžaduje se fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase.

2. Pro experiment jsou vyžadovány speciální qPCR reakční zkumavky nebo reakční destička, které však nejsou součástí této sady.

3. Primery a sondy QPCR (referenční primery a principy návrhu sond) jsou vyžadovány, ale nejsou součástí této sady.

 

 

1. Doporučený reakční systém PCR:

Komponent	20 μl rxn	Závěrečné soustředění
2× Universal Blue Multiplex Probe qPCR Master Mix (s UDG)	10 μL	1×
Forward Primer (10 μM)a	Variabilní	0.1-0.5 μM
Reverzní primer (10 μM)a	Variabilní	0.1-0.5 μM
Sonda (10 μM)a	Variabilní	0.1-0.5 μM
Templateb	Variabilní	podle potřeby
Voda bez nukleázy	Přidejte do 20 μl

 

A. Obvykle lze dobrého zesilovacího účinku dosáhnout s konečnou koncentrací {{0}},2 μM. Když je výkon reakce špatný, lze koncentraci primeru upravit v rozsahu 0.12-1.0,5 μM.

b. Množství přidaného templátu se mění s počtem kopií cílových genů v templátovém roztoku. Gradient nařeďte šablonu a prozkoumejte vhodné množství přidané šablony. V reakčním systému 20 μl by množství templátové DNA mělo být menší než 100 ng. Při použití cDNA (RT reakční roztok) reakce RT-PCR jako templátu by množství přidání nemělo přesáhnout 10 % celkového objemu reakčního roztoku PCR.

2. Postup PCR reakce (lze upravit podle modelu):

A. Dvoukroková metoda					B. Tříkroková metoda
Fáze	Krok	Cyklus	Temp	Čas	Fáze	Krok	Cyklus	Temp	Čas
Fáze 1	UDG inkubace	1	50 stupňů	2 min	Fáze 1	UDG inkubace	1	50 stupňů	2 min
Fáze 2	Před- denaturace	1	95 stupňů	30 sec	Fáze 2	Před- denaturace	1	95 stupňů	30 sec
Fáze 3	Denaturace	40	95 stupňů	15 sec	Fáze 3	Denaturace	40	95 stupňů	15 sec
	Žíhání /Rozšíření		60 stupňů	30 sec		Žíhání		55-65 stupeň	10 sec
						Rozšíření		72 stupňů	30 sec

A. Pro zlepšení specifičnosti amplifikace lze použít dvoustupňový postup nebo lze zvýšit teplotu nasedání. Pro zlepšení účinnosti amplifikace lze použít tříkrokový postup nebo prodloužit dobu prodloužení.

Poznámka

1. Po rozmrazení jemně promíchejte nahoru a dolů, nevortexujte, vyhněte se bublinám, před použitím dobře promíchejte.

2. Při přípravě reakčního roztoku umístěte činidlo na led.

3. Produkt obsahuje fluorescenční barviva, proto je třeba se při přípravě reakčního roztoku qPCR vyhnout silnému světlu.

4. Pro přípravu reakčních směsí by měly být použity nové jednorázové špičky, aby se zabránilo křížové kontaminaci.

5. Vyhněte se cyklům zmrazování a rozmrazování Master Mix a pokuste se jej spotřebovat do jednoho měsíce po rozmrazení.

 

 

ABI: 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, řada QuantStudio™, PikoRealTM Cycler;

Stratagene: Mx3000P®, 3005P™, 4000™;

Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™; Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;

Ilumina: Eco QPCR;

Cepheid: SmartCycler®;

Qiagen Corbett: řada Rotor-Gene®;

Roche: řada LightCycler™;

Série Takara: Thermal Cycler Dice;

Analytika: řada qTOWER;

Hangzhou Bori: řada LineGene;

 

 

Princip návrhu primeru Taqman

1. Před navržením primerů určete sondu.

2. Při navrhování primerů se přibližte co nejblíže sondě, aniž byste sondu překrývali.

3. Nepoužívejte 4 nebo více po sobě jdoucích G.

4. Hodnota Tm každého primeru by měla být 58-60 stupně.

5. Posledních 5 nukleotidů na konci primeru nemůže mít více než 2 G a C.

6. Primery by neměly obsahovat samokomplementární sekvence, jinak budou tvořit vlásenky.

7. Aby se zabránilo amplifikaci genomu, je nejlepší navrhnout primery napříč exony.

8. Délka amplifikačního produktu by měla být 50-150 bp, aby se dosáhlo nejlepší účinnosti PCR.

9. Ve výsledcích srovnání na NCBI nebyly nalezeny žádné další nespecifické produkty.

 

 

1. Délka sondy by měla být 13-25 bp (13-30 bp, pokud je použita konvenční sonda TaqMan).

2. Hodnota Tm by měla být 65 stupňů ~70 stupňů, což je obvykle o 5 stupňů ~10 stupňů vyšší než hodnota TM primeru, aby se zajistilo, že se sonda přednostně váže na cílový gen během nasedání.

3. U primeru by měl být obsah guanin-cytosinu (G+C) mezi 40 % a 70 %.

4. 5' konec sondy by se neměl používat G, protože 5' konec G bude mít zhášecí účinek, i když bude odříznut.

5. V celé sondě je obsah C zjevně vyšší než obsah G a vysoký obsah G bude mít zhášecí účinek, takže jako sondu můžeme zvolit jiný párový řetězec.

Princip konstrukce sondy Taqman MGB

1. K 5' konci sondy je připojeno barvivo (například FAMTM).

2. Na 3' konci sondy je nefluorescenční zhášecí skupina (NFQ).

3. Část MGB je připojena k NFQ a MGB zvyšují teplotu žíhání (Tm) bez zvýšení délky sondy, takže lze navrhnout kratší sondu, ale ne méně než 13 bp.

4. V zásadě platí, že pokud je v sondě MGB mutace báze, MGB ji může detekovat (sonda MGB se neváže na cílový gen a nevytváří fluorescenční signál).

 

Pouze pro výzkumné účely!

 

 

Populární Tagy: 2× univerzální modrá multiplexní sonda qpcr hlavní mix（s udg）, Čína 2× univerzální modrá multiplexní sonda qpcr hlavní mix（s udg） výrobci, dodavatelé, továrna