Imunoprecipitační sada (Protein A/G Magnetic Beads)

IP nebo Co-IP je běžná experimentální technika pro studium proteinových nebo protein-proteinových interakcí (PPI) pomocí specifických protilátek a média, které váže protilátky (např. Protein A/G agaróza nebo Protein A/G magnetické kuličky), nebo přímo pomocí médium spojené se specifickými protilátkami (např. agarózové gely nebo magnetické kuličky) a poté izolací komplexů antigen-protilátka z komplikovaných vzorků proteinů centrifugací nebo magnetickou silou, které lze následně použít pro Western blot popř. hmotnostní spektrometrie. Protein G je protein vázající imunoglobulin exprimovanýStreptokokové bakterietypu C nebo G. Protein A je povrchový protein buněčné stěny nacházející se vStaphylococcus aureuss molekulovou hmotností 42 kDa. Protein A a Protein G jsou funkčně podobné a mohou se specificky vázat na savčí imunoglobulin (Ig). Rekombinantní proteiny A a G s vhodnými modifikacemi navázanými na magnetické kuličky mohou být použity pro imunoprecipitaci nebo purifikaci protilátek. Magnetické kuličky Protein A jsou vhodné pro imunoprecipitaci lidských IgG1, IgG2, IgG4, myších IgG2a, IgG2b, zatímco magnetické kuličky Protein G jsou vhodné pro imunoprecipitaci lidských IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, myší IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 , potkaní IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c polyklonální protilátky. (Konkrétní informace naleznete v tabulce I.)

Tento produkt využívá samostatně vyvinuté a vyrobené magnetické kuličky značené proteinem A/G proteinem, ve srovnání s podobnými produkty na trhu tento produkt váže protilátky účinněji a má nižší nespecifickou vazebnou rychlost, spolu s optimalizovaným pufrem. mohou být vhodné a účinné pro imunoprecipitační experimenty; může být široce používán při izolaci a čištění cílových proteinů ve vzorcích, jako jsou buněčné lyzáty, supernatanty buněčné sekrece, sérum, ascites atd.; Tato souprava poskytuje dvě eluční metody (denaturační eluci a kyselou eluci) k eluci cílového proteinu, zejména kyselá eluce nebude obsahovat lehké a těžké řetězce protilátky, což může účinně vyřešit problém interference těžkého a lehkého řetězce protilátky. řetězce v imunoprecipitačních a proteinových imunoblotovacích experimentech.

Loď s mokrým ledem; 5X SDS-PAGE nakládací vyrovnávací paměť (snížená) by měla být skladována při -20 stupních a jiná při 2-8 stupních po dobu 12 měsíců.

1. Příprava soupravy

a) Podle níže uvedené tabulky připravte příslušné reagencie v poměru 100-500 μl lyzátu na vzorek;

b) Příprava IP lyzátu obsahujícího inhibitor proteázy: Viz výše uvedená tabulka, použijte {{0}} μl IP lyzátu obsahujícího inhibitor proteázy na 0.5-1 milionů buněk pro lýzu; smíchejte IP lyzát s 50x inhibitorem koktejlové proteázy (doporučuje se G2006-250UL) v poměru 50:1, například přidejte 20 μl 50x inhibitoru koktejlové proteázy do 1 ml IP lyzátu, poté 1 ml Bude získán IP lyzát obsahující inhibitor proteázy; připravený IP lyzát obsahující inhibitor by měl být umístěn v ledové lázni nebo při teplotě 4 stupňů.

c) Poznámka: Pokud cílový protein imunoprecipitace zahrnuje fosforylační nebo acetylační modifikaci, měl by být přidán inhibitor fosfatázy nebo inhibitor deacetylázy (samotný); IP lyzát obsahující inhibitor by měl být připraven před použitím a neměl by být zmražen a uchován pro další použití.

d) Příprava 1×TBS: Zřeďte 10×TBS pufr ultračistou vodou na 1×TBS. Například přidejte 1 ml 10×TBS pufru do 9 ml ultračisté vody, což je po dobrém promíchání 1×TBS pufr.

e) Příprava 1x nanášecího pufru SDS-PAGE (redukovaného): vhodné množství 5x nanášecího pufru SDS-PAGE (redukovaného) bylo zředěno 5krát ultračistou vodou za vzniku 1x nanášecího pufru SDS-PAGE (redukovaného); například smíchejte 0,2 ml 5x proteinového pufru (redukovaného) s 0,8 ml ultračisté vody, což je 1x nakládací pufr SDS-PAGE (redukovaný).

2. Příprava vzorku antigenu

Imunoprecipitační nebo imunoprecipitační experimenty by měly být provedeny ihned po lýze vzorků, pokud ne, mohou být vzorky skladovány v chladničce při -20 stupni nebo -80 stupni, ale zmrazování a rozmrazování může ovlivnit interakce protein-protein; všechny kroky lýzy vzorku by měly být prováděny v ledové lázni nebo při 4 stupních, aby se minimalizovala degradace proteinu, a určité množství vzorku by mělo být odebráno jako vstup nebo celkem poté, co byl vzorek připraven pro následnou detekci pomocí Western Blot.

Pro vzorky tkáně:

a) Tkáně by měly být opláchnuty v předem vychlazeném PBS, aby se důkladně odstranila přebytečná krev. Zvažte a nasekejte na malé kousky v homogenizátoru na ledu.

b) Přidejte IP lyzát obsahující inhibitor proteázy v poměru 100-200 μl na 10-20 mg tkáně nebo snižte množství IP lyzátu, pokud jsou vyžadovány vyšší koncentrace proteinu.

c) Homogenizujte skleněným homogenizátorem nebo ručním homogenizátorem, nebo použijte náš vlastní vyvinutý nízkoteplotní mlýnek KZ-III-F pro úplné mletí.

d) Homogenát se přenesl do 1,5ml centrifugační zkumavky, protřepal a promíchal a 30 minut koupal v ledu, opakujte profouknutí pipetou každých 10 minut, aby se zajistila úplná lýza tkáňových buněk.

e) Centrifugujte při 12,000 xg po dobu 5 minut při 4 stupních, sraženinu a supernatant odsajte pro následné imunoprecipitační nebo imunoprecipitační experimenty.

Pro vzorky adherentních buněk:

a) V případě potřeby lze buňky 2-3krát omýt PBS, naposled důkladně absorbovat zbytkovou tekutinu.

b) Seškrábněte buňky buněčnou škrabkou nebo buňky štěpte trypsinem, aby byly plně suspendovány, shromážděte je do 1,5ml centrifugační zkumavky a centrifugujte při 1,000xg po dobu 5 minut při 4 stupních, supernatant zlikvidujte. shromážděte buněčnou sraženinu.

c) Přidejte {{0}} μl IP lyzátu obsahujícího inhibitor proteázy na 0.5-1 milion buněk (ekvivalent jedné jamky 6-jamkové destičky); přiměřeně foukejte a ledovou lázeň po dobu 3-5 min, aby došlo k úplné lýze buněk, a po úplné lýze by nemělo dojít k žádnému zjevnému vysrážení buněk; pokud je množství buněk větší, doporučuje se, aby byly buňky rozděleny na 0,{6}} milionů buněk/zkumavku, aby došlo k úplné lýze.

d) Centrifugujte při 12, 000 xg po dobu 5 minut při 4 stupních, zlikvidujte sraženinu a aspirujte supernatant pro následné imunoprecipitační nebo imunoprecipitační experimenty.

Pro vzorky suspendovaných buněk:

a) Odstřeďujte při 1000 g po dobu 5 minut při 4 stupních, aby se shromáždila sraženina; pokud je to nutné, jednou promyjte PBS, poté odsajte zbylou kapalinu a jemně promíchejte, aby se buňky co nejvíce rozptýlily.

b) Přidejte {{0}}} μl IP lyzátu obsahujícího inhibitor proteázy na 0.5-1 milion buněk (ekvivalent jedné jamky 6-jamkové destičky); vhodným foukáním a ledovou lázní po dobu 3-5 min., aby došlo k úplné lýze buněk; pokud je množství buněk větší, doporučuje se, aby byly buňky rozděleny na 0,{6}} milionů buněk/zkumavku, aby došlo k úplné lýze.

c) Centrifugujte při 12 000 xg po dobu 5 minut při 4 stupních, sraženinu a supernatant odsajte pro následné imunoprecipitační nebo imunoprecipitační experimenty.

Pro vzorky bakterií nebo kvasinek:

a) Vezměte 1 ml bakteriálního nebo kvasinkového roztoku a centrifugujte, abyste odstranili supernatant. V případě potřeby lze buňky jednou omýt PBS, naposledy důkladně absorbovat zbytkovou tekutinu. Jemně vortexujte, aby se buňky co nejvíce rozptýlily.

b) Přidejte 100-200 μl IP lyzátu obsahujícího inhibitor proteázy a jemně profoukněte, aby se bakterie nebo houby úplně rozptýlily.

c) Ledová lázeň po dobu 10 minut, pro lepší lýzu mohou být bakterie a kvasinky štěpeny lysozymem a enzymem štěpícím stěnu (samoobstaraný) a poté lyzovány IP lyzátem obsahujícím inhibitory proteázy.

d) Centrifugujte při 12, 000 xg po dobu 5 minut při 4 stupních, zlikvidujte sraženinu a aspirujte supernatant pro následné imunoprecipitační nebo imunoprecipitační experimenty.

3. Příprava magnetické kuličky

a) Jemně resuspendujte magnetické kuličky SweMagrose Protein A/G, aby se co nejvíce vytvořila homogenní disperze kuliček, přidejte 20 ul dobře promíchané disperze kuliček na každých 500 ul vzorku, odeberte přiměřené množství magnetické kuličky do čisté EP zkumavky a přidejte 1x TBS do konečného objemu 0,5 ml (20 ul perličkové disperze pro každý vzorek se používá v následujícím imunoprecipitační kroky jako příklad).

b) Jemně resuspendujte magnetické kuličky, umístěte je na magnetický separační stojan na 30 s, opatrně odstraňte supernatant a dvakrát opakujte výše uvedené kroky.

c) Magnetické kuličky byly resuspendovány s 1x TBS podle objemu počáteční disperze kuliček.

4. Vazba protilátky na magnetické kuličky SweMagrose Protein A/G

a) Příprava protilátky: nařeďte protilátku 1x TBS, abyste připravili pracovní roztok protilátky podle ředícího poměru doporučeného v návodu k použití protilátky, nebo připravte protilátku na pracovní roztok protilátky s konečnou koncentrací 5-50 ug/mL , které lze připravit na ledu;volitelný:použijte normální IgG stejného druhu protilátky k přípravě normálního pracovního roztoku IgG se stejným poměrem ředění nebo konečnou koncentrací 5-50 ug/mL, odstraňte nespecifickou vazbu nebo poslouží jako negativní kontrola. Normální IgG stejného druhu znamená, že pokud je protilátkou použitou v následné imunoprecipitaci myší IgG, lze v tomto kroku zředit vhodné množství normálního myšího IgG 1x TBS, aby se snížilo pozadí nebo jako negativní kontrola.

b) Adsorpce protilátky: Magneticky oddělte magnetické kuličky SweMagrose Protein A/G připravené v kroku 3, odsajte supernatant, přidejte 500 μl pracovního roztoku protilátky nebo normálního pracovního roztoku IgG, resuspendujte a poté inkubujte po dobu 15-60 min při pokojové teplotě na otočném mixéru.

Poznámka: Magnetické kuličky SweMagrose Protein A/G připravené v kroku 3 je také možné inkubovat přímo s vhodným množstvím protilátky nebo normálního IgG.

c) Magnetická separace a promývání: Oddělte inkubované kuličky magneticky, odsajte supernatant, přidejte 500 μl 1×TBS, resuspendujte kuličky SweMagrose Protein A/G jemným profouknutím pipetou, umístěte na magnetický separační stojan na 10 s , odstraňte supernatant, opakujte promytí třikrát a resuspendujte kuličky s 1×TBS ve stejném množství jako počáteční objem.

Poznámka: Pokud jsou kuličky aglomerované nebo vločkovité během inkubace a promývání, je to normální jev a neovlivní výsledky experimentu.

5. Imunoprecipitace (IP):

a) Odstranění nespecifické vazby (volitelné): kuličky SweMagrose Protein A/G připravené v kroku 4, které vážou normální IgG, se inkubují se vzorky při 4 stupních po dobu 60 minut a oddělí se magnetickým odsáváním a supernatanty se použit pro následné experimenty; účelem tohoto kroku je odstranit proteiny, které se nespecificky vážou na normální IgG.

b) Inkubace vzorků s kuličkami SweMagrose Protein A/G konjugovanými s protilátkou nebo normálním IgG: přidejte kuličky SweMagrose Protein A/G konjugované s protilátkou nebo normálním IgG v poměru 20 ul suspenze kuliček na každých 500 ul vzorku proteinu, umístěte na boční oscilační třepačce nebo rotačním mixéru a inkubujte 2 hodiny při pokojové teplotě nebo přes noc při 4ºC.

Poznámka 1: Pokud jsou kuličky aglomerované nebo vločkovité během inkubace a promývání, je to normální jev a neovlivní výsledky experimentu.

Poznámka 2: Alternativně lze příslušné množství protilátky nebo normálního IgG inkubovat se vzorkem po dobu 1-2 hodin při pokojové teplotě nebo přes noc při 4 stupních a poté lze přidat 10-20 μL suspenze magnetických kuliček a inkubuje se 60 minut při teplotě místnosti.

c) Magnetická separace: po inkubaci umístěte na 10 sekund na magnetický separační stojan, abyste odstranili supernatant.

Poznámka:Ponechte si část supernatantu pro testování účinku imunoprecipitace.

d) Promytí: Přidejte 500 ul 1×TBS, jemně profoukněte resuspendované kuličky pipetou, umístěte na magnetický separátor na 10 sekund, abyste odstranili supernatant a promytí opakujte třikrát.

Poznámka: Můžete také otestovat OD280 promývacího roztoku, abyste zjistili, zda je promývání dokončeno, pokud je OD280 větší než 0,05, počet dob ​​mytí by se měl přiměřeně zvýšit.

6. Eluce

V závislosti na charakteristikách cílového proteinu a požadavcích následných experimentů lze pro eluci vybrat jednu z následujících metod.

a) Denaturační eluční metoda:Vzorky eluované touto metodou jsou vhodné pro SDS-PAGE. Vyjměte EP zkumavku z magnetického separátoru, přidejte 25 µl 1× Protein Sampling Buffer (redukovaný) do zkumavky, zahřívejte na 95 stupňů po dobu 5 minut a poté proveďte magnetickou separaci, abyste shromáždili supernatant pro detekci Western blot..

b) Kyselá eluce:Vzorek eluovaný touto metodou si zachovává svou původní biologickou aktivitu a může být použit pro postfunkční analýzu. Vyjměte EP zkumavku z magnetického separačního stojanu, přidejte 20 µl Acid Elution Buffer do zkumavky, dobře promíchejte a inkubujte při pokojové teplotě po dobu 10 minut, poté proveďte separaci magnetickou sáním, odeberte supernatant do nové EP zkumavky a ihned přidejte 2 µl neulizačního elučního pufru pro úpravu pH eluovaného produktu na neutrální, což lze použít pro postfunkční analýzu.

Poznámka: Uživatel může upravit množství přidaného elučního pufru podle požadovaného objemu.

1. Neskladujte SweMagrose Protein A/G v soupravě při -20 stupních ani opakovaně nezmrazujte a nerozmrazujte, jinak to ovlivní výkon magnetických kuliček a způsobí zbytečné experimentální chyby.

2. Před provedením imunoprecipitace si prosím pečlivě přečtěte tyto pokyny.

3. Magnetický separační rám pro magnetickou separaci je třeba zajistit samostatně

4. Pokud imunoprecipitovaný cílový protein zahrnuje fosforylační nebo acetylační modifikaci, měly by být poskytnuty vhodné inhibitory fosfatázy a inhibitory deacetylázy.

5. Udržujte kuličky při pH 6-8, vyhněte se vysokorychlostní centrifugaci, sušení nebo zmrazování; nevystavujte kuličky magnetickým polím po dlouhou dobu, což může způsobit aglomeraci kuliček.

6. Kuličky by měly být před použitím důkladně promíchány, operace míchání by měla být jemná a neměla by být vystavena prudkému víření a třepání, aby nedošlo k denaturaci protilátky.

7. Při imunoprecipitaci se doporučují pozitivní a negativní kontroly (SweMagrose Mouse IgG).

8. Vzorky proteinů by měly být purifikovány co nejdříve po odběru a vždy umístěny při 4 stupních nebo v ledové lázni, aby se zpomalila degradace proteinu nebo denaturace

9. Magnetické kuličky se mohou shromažďovat při použití s ​​kyselou elucí, což je normální jev a nemá vliv na normální použití magnetických kuliček.

10. Pouze pro výzkumné účely. Není určeno pro diagnostické nebo terapeutické postupy.

11. Používejte vhodný ochranný oděv, jako je laboratorní kombinéza, ochranné brýle a rukavice.

12. Vazebná kapacita proteinu A a proteinu G k protilátkám různých generických zdrojů a podtypů je uvedena v tabulce I.

Tabulka 1

Pouze pro výzkumné použití. Není určeno pro diagnostické nebo terapeutické postupy!

Populární Tagy: imunoprecipitační sada (proteinové a/g magnetické kuličky), čínská imunoprecipitační sada (proteinové a/g magnetické kuličky), výrobci, dodavatelé, továrna